Галактозидаза


Категория на документа: Икономика


β -Галактозидаза

1.Субстрат. Субстрати за действието на β-галактозидазата (β-D-галактозидгалактохидралаза, КЕ 3.2.1.23, лактаза ) са β-D -галактозиди, гликолипиди , гликопептиди, гликопротеиди и мукополизахариди, в които ензимът катализира хидролитичното разграждане на β-D-галактозидните връзки от нередуциращия край, отцепвайки галактозни остатъци.

Свойства на β-галактозидазата. β-галактозидазите, получени от различни микробни източници, се разделят на два типа в зависимост от мястото им на секретиране , строежа на молекулата и физикохимичните им свойства.Първи тип - вътреклетъчни , към които се отнасят β-галактозидазите от бактериен и дрождев произход. Те се характеризират със събединична стръктура, молекулна маса над 200 000, зависимост на каталитичното им действие от присъствието на Mg2+ ,Mn2+ и SH- групи, по-висок pH-opтимум на действие и др. Така , β-галактозидазата от E. coli , Str.thermophilus и L. helveticus представлява тетрамер , от L.sporogenus - димер, а ензимът от B. subtilis съществува в 3 изоформи, всяка от които съдържа различен брой субединици( 1,2 и 4 ) . чрез сканираща електронна микроскопия е установена олигомерната природа на β-галактозидазата от K. fragilis, съставена 10 субединици. Първичната структура на вътреклетъчните β-галактозидази се отличава с по- високо съдържание на сяросъдържащи аминокиселини.Данните за йонизационната константа (pKa) , топлинната йонизация, влиянието на pH и йонната сила върху ензимната активност свидетелстват за участие на имидазола на хистидина в каталитичния акт. А инхибирането на β-галактозидазното действие от р-хлормеркурибензоата и от йоните на тежките метали ( Hg2+, Ag+, Zn2+ , Pb2+,Cu2+ ) доказателство за наличието на свободни SH- групи в активниа център и участието им в каталитичното действие.
Втори тип - външноклетъчни , към които се отнасят β-галактозидазите от плесенен произход. Тяхната молекулна маса е под 200 000, имат мономерна структура , но за накои ( напр. P. canescens, A.oryzae ) , е доказана субединична структура. Този тип ензим представлява гликопротеин, в който въглехидратният компонент е от 5 до 30 % от молекулната маса и включва различни захари - галактоза, глюкоза , маноза, рамноза, фруктоза,ксилоза, N- ацетилглюкозамин и др.Наличието на въглехидратен фрагмент придава на ензима продължителна стабилност към външни въздействия ( pH , температура ). Този тип β-галактозидази имат високо съдържание на аминокиселини с отрицателно заредени групи, което определя тяхната изоелектрична точка в киселата област на pH ( PI=4,4-4,6 ) . Въпросът за наличието на SH - групи в активния център и влиянието на различни метални йони върху действието на външноклетъчния ензим засега е дискусионен.
Външноклетъчните β-галактозидази имат по-широки граници на действие по отношение на pH и температура , както и по-висока pH - и температурна стабилност в сравнение с вътреклетъчните ензими.

2.Източници на β-галактозидаза . β-галактозидазата е широко разпространена в животински и растителни тъкани . Съдържа се в тънките черва , слюнката ,плазмата и суроватката на кръвта, в урината на млекопитаещи, особено в периода на хранене с мляко и лактация.Ензимът е изолиран от семена на соя, кафе, люцерна и др. Висшите еукариоти не представляват интерес като източник за промишлено изолиране на ензима от тях.

β-Галактозидазата се продуцира от много микроорганизми- бактерии, дрожди, плесенни гъби. При бактериите и дрождите ензимът е вътреклетъчен , а при плесенните гъби се секретира в културалната среда. Най-пълно и всестранно е проучена β-галактозидаза от E.coli , в резултат на което е предложен механизмът на регулиране на синтеза на белтъка в прокариотите. Е. Coli е обект на генно - инженерни манипулации, при които са получени мутанти, продуциращи конститутивен ензим поради изменен геном, отговорен за синтезата на репресора, както и мутанти с удвоени структурни гени , от които се копира информация за синтезата на β-Галактозидаза.

β-Галактозидазата се продуцира от млечнокисели бактерии ( Lactobacillus helveticul, L. bulgaricus, L. lactis, S. thermophilus, S. lactis и др. ) Някои спорообразуващи бактерии ( B. subtilis, B. stearothermophilus ) синтезират термостабилна β-Галактозидаза.
От дрождевите култури активно синтезират β-галактозидаза Kluyveromyces ( Fabospra, Saccaharomyces ) , fragilis, K. lactis , K. marxianus, Candida pseudotropicalis, S .cerevisiae и др. Дрождите са нормална микрофлора на млечните продукти и затова те най напред са използвани като промишлени продуценти на този ензим. Търговският препарат Maxilact LX на фирмата Gist Brocades се получава от K. lactis.
β-Галактозидаза образуват голям брой плесенни гъби - Aspergillus niger , A. oryzae, A. flavus, A. nidulans, A. foetidus, Alternaria tenuis, Penicillium multicolor, P. canescens, Mucor pusillus, Curvularia inaequalis, Scopulariopsis sp. , Beauveria bassiana, Fusarium moniliforme и др. Промишлено приложение имат А. Niger ( Rapidase ), A. oryzae ( Rohm ) .Съществено предимство на плесенните продуценти пред дрождевите и бактерийните е , че секретират β-Галактозидазата в културалната среда , което значително облекчава изолирането и. Освен това , за разлика от дрождевите β-галактозидази , плесенните са по-устойчиви към външни въздействия ( pH , температура, метални йони ) , затова се предпочитат за практическо приложение.
Естествен субстрат за действието на ензима е лактозата ( млечна захар ) , 4- 0- β- D- галактопиранозил- β- D- глюкопираноза ) . Известно е , че лактозата съществуват в α - и β- форма , чието съотношение зависи от температурата . При ниски температури равновесието се измества към по- слаборазтворимата α - форма.
β-Галактозидазата проявява каталитично действие и спрямо редица синтетични галактопиранозиди : β-D- фенилгалактопиранозид, о- и р-нитрофенил- β-D- галактопиранозид ( ONPG , PNGP ) , лактулоза ( 4-0- β-D- галактопиранозилфруктоза ) - кетоаналог на лактозата ,който не съществува в природата , лактобионова киселина ( 4-0- β-D-галактопиранозил- β-глюконова киселина ) .

3. Получаване на препарати на β-галактозидаза . През 1959 г. е изолирана β-галактозидаза от E. coli под формата на кристали, а през 1968 г. е получен първият високопречистен препарат от K. lactis.
Етапите на изолиране и пречистване на β-галактозидазата се определят от локализацията и и от нужната чистота на препарата. Изолирането на вътреклетъчната β-галактозидаза се прехожда от дезинтегриране на клетките, което се постига чрез ултразвук, естествена автолиза при повишена температура ( 2-3 h при 60 С ) или обработка с толуол.
Културални течности, съдържащи външноклетъчен ензим, се подлагат на частично пречистване и концентриране чрез ултрафилтрация с подходящи мембрани. От получените концентрати чрез разпръсквателно сушене могат да се получат сухи ензимни препарати, при което предварително се прибавят стабилизатори и пълнители . Благоприятентемпературен режим за сушене в този случай е 120 С на входа и 60 С на изхода на топлоносителя . За получаване на течни ензимни препарати ултраконцентратът се подлага на вакуумизпаряване до съдържание на с.в. 20-25 % , след което се прибават пълнители до с.в. 35-40% и антисептик 0,1 % ( калиев сорбат ) .
За получаване на препарати с по-висока степен на пречистване се прилага утаяване на ензима с органични разтворители, изсолване с ( NH4)2SO4 , гел-филтрация, хроматографиране на различни носители, афинитетна сорбция и др.
Високопречистен препарат на β-галактозидаза от A. oryzae H 26-10-7 е получен чрез ултрафилтрация, утаяване с етилов алкохол в съотношение 1:1 и хроматографиране на ДЕАЕ- целулоза, при което специфичната активност е 93,42 Е/mg белтък, степента на пречистване - 18,2 пъти, а добивът - 39,6 % .




Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Галактозидаза 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.